MacFarlane dilahirkan dan dibesarkan di Kent, Connecticut. Ibu bapanya, Ronald Milton MacFarlane (lahir 1946) dan Ann Perry (née Sager, 1947–2010), dilahirkan di Newburyport, Massachusetts.[4] Adik perempuannya ialah pelakon suara Rachael Ann MacFarlane (lahir 1976). Beliau mempunyai keturunan di New England pada 1600-an, penumpang Mayflower, William Brewster.[1] Ibu bapa MacFarlane bertemu pada tahun 1970, ketika mereka berdua tinggal dan bekerja di Boston, Massachusetts, dan berkahwin pada tahun itu.[4] Pasangan itu berpindah ke Kent pada tahun 1972, di mana Ann mula bekerja di Pejabat Kemasukan di South Kent School. Beliau kemudiannya bekerja di Pejabat Bimbingan Kolej dan Kemasukan di Kent School, sebuah sekolah persediaan kolej terpilih, di mana Ronald adalah seorang guru.[4][5]

Semasa zaman kanak-kanaknya, MacFarlane mengembangkan minat dalam ilustrasi dan mula melukis watak kartun Fred Flintstone dan Woody Woodpecker, seawal umur dua tahun.[6] Pada usia lima tahun, MacFarlane tahu bahawa beliau ingin meneruskan kerjaya dalam animasi, dan bermula dengan membuat buku flip, selepas ibu bapanya menemui buku mengenai subjek untuknya.[7] Empat tahun kemudian, berusia sembilan tahun, MacFarlane mula menerbitkan komik mingguan berjudul "Walter Crouton" untuk The Kent Good Times Dispatch, akhbar tempatan di Kent, Connecticut, yang membayar beliau lima dolar seminggu.[8][9] Dalam satu anekdot dari masa itu, MacFarlane berkata dalam wawancara Oktober 2011 bahawa sebagai seorang kanak-kanak beliau sentiasa "sangat pelik dengan upacara Komuni". Beliau mencipta jalur dengan watak yang berlutut di mezbah yang mengambil Komuni dan bertanya "Bolehkah saya mempunyai kentang goreng dengan itu?" Kertas dicetak dan dia mendapat "surat marah" dari paderi tempatan; ia membawa kepada "semacam sedikit kontroversi kecil" di bandar itu.[10]

MacFarlane menerima diploma sekolah tinggi pada tahun 1991 dari Kent School.[4][5] Semasa di sana, beliau terus berminat dengan animasi, dan ibu bapanya memberinya kamera 8 mm.[9] MacFarlane meneruskan kajian filem, video dan animasi di Rhode Island School of Design (RISD), di mana beliau memperoleh Ijazah Sarjana Muda Seni Halus.[8] Sebagai seorang pelajar, beliau pada mulanya bercita-cita bekerja untuk Disney, tetapi berubah fikirannya apabila menerima ijazah.[11] Di RISD, MacFarlane mencipta satu siri filem bebas, secara kebetulan bertemu dengan ahli pelakon Family Guy pada masa depan, Mike Henry, yang saudara lelakinya Patrick adalah rakan kelas MacFarlane. Semasa beliau di RISD, MacFarlane mempersembahkan komedi berdiri.[12] Pada tahun yang sama di RISD, MacFarlane mencipta filem tesis bertajuk The Life of Larry, yang akhirnya menjadi inspirasi untuk Family Guy.[8] Profesor MacFarlane menyerahkan filemnya ke studio animasi Hanna-Barbera, di mana beliau kemudiannya diupah.[13]